枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)

       枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)是一種常用于生產(chǎn)外源蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)，它具有非致病性、分泌蛋白能力強(qiáng)等特點(diǎn)，是目前原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)和分泌外源蛋白的理想宿主。

       相比大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有更高的蛋白產(chǎn)量、更好的生物活性，同時內(nèi)毒素含量較低，蛋白可溶性好。此外，枯草芽孢桿菌能夠適應(yīng)低溫培養(yǎng)條件，適用于工業(yè)酶等蛋白的生產(chǎn)。

       相比大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有更高的蛋白產(chǎn)量、更好的生物活性，同時內(nèi)毒素含量較低，蛋白可溶性好。此外，枯草芽孢桿菌能夠適應(yīng)低溫培養(yǎng)條件，適用于工業(yè)酶等蛋白的生產(chǎn)。

基因克隆  

        首先要對外源基因片段進(jìn)行密碼子優(yōu)化，確保其在枯草芽孢桿菌中能夠高效表達(dá)。隨后，將優(yōu)化后的基因片段連接到合適的表達(dá)載體上。

表達(dá)載體的選擇與轉(zhuǎn)化

        選擇合適的表達(dá)載體對于蛋白的表達(dá)至關(guān)重要。常用的載體包括pHT系列載體，如pHT01和pHT43，它們能夠在枯草芽孢桿菌中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。轉(zhuǎn)化過程可通過電擊法、化學(xué)法等方式進(jìn)行，目的是讓攜帶外源基因的載體進(jìn)入枯草芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)。

培養(yǎng)與表達(dá)

        將轉(zhuǎn)化后的陽性克隆株進(jìn)行培養(yǎng)，在適宜條件下表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)。表達(dá)過程中，可以通過優(yōu)化培養(yǎng)基配方、調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件來提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。通常在培養(yǎng)至OD600=0.8-1.0時，添加IPTG誘導(dǎo)劑進(jìn)行表達(dá)。

1.塊狀沉淀：這是枯草芽孢桿菌在發(fā)酵后期可能會產(chǎn)生的物質(zhì)，屬于正?，F(xiàn)象

2.轉(zhuǎn)化效率：枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化效率相對比較低，推薦使用高轉(zhuǎn)化率的感受態(tài)或者采用電擊法進(jìn)行轉(zhuǎn)換。

3.胞內(nèi)外蛋白分析：

（1）針對胞內(nèi)表達(dá)，可以直接使用超聲波破碎細(xì)胞后分析；

（2）針對胞外分泌表達(dá)，可以使用TCA方法或相關(guān)標(biāo)簽樹脂進(jìn)行純化分析

常用菌種：

菌株168：適用于胞內(nèi)表達(dá)?？莶菅挎邨U菌168菌株具有強(qiáng)大的分泌蛋白質(zhì)的能力，相比于大腸桿菌，枯草芽孢桿菌的細(xì)胞壁組成更為簡單，不含類似革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁成分中的熱源性脂多糖（內(nèi)毒素），能高效表達(dá)hFGF21、幾丁質(zhì)酶、阿洛酮糖異構(gòu)酶、低聚半乳糖苷酶、甘露聚糖酶等9個異源蛋白質(zhì)。[1]

菌株AS1：它可以作為胞內(nèi)和胞外表達(dá)的通用菌。由于AS1菌株沒有明顯的密碼子偏愛性，因此在表達(dá)外源蛋白時無需對DNA序列進(jìn)行優(yōu)化。

菌株WB800N：枯草芽孢桿菌自然擁有高效的蛋白分泌系統(tǒng)，能夠?qū)⒛康牡鞍字苯臃置诘桨?。而且WB800N菌株是一株胞外蛋白酶缺陷的菌株，這意味著它不會像其他枯草芽孢桿菌那樣降解表達(dá)的外源蛋白，從而提高了蛋白表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。

常見載體：

pHT01：pHT01是一種大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒的表達(dá)載體，可以在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)重組外源蛋白。

pHT254：pHT254是一種枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)型表達(dá)載體，具有pgrac100啟動子，其啟動活性是普通pgrac啟動子的8倍。

pHT43：pHT43是一種枯草芽孢桿菌表達(dá)載體，它的特點(diǎn)是通過IPTG誘導(dǎo)，能夠高水平分泌表達(dá)目的蛋白。編碼α-淀粉酶的amyQ基因的信號肽編碼區(qū)域與pHT01的SD序列融合，構(gòu)成了pHT43，以此獲得分泌的重組蛋白。

pTD161：這是一個帶有淀粉酶信號肽的分泌表達(dá)載體，可以用于外源蛋白的分泌表達(dá)。

pTD162：這是一個表面展示載體，可以用于外源蛋白與胞衣蛋白cotG的融合表達(dá)。

pBE2：pBE2是是天津大學(xué)趙學(xué)明教授提供的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒，它可以同時在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中復(fù)制，并在枯草芽孢桿菌中表達(dá)外源蛋白。

pSA60：pSA60是一個含有枯草芽孢桿菌sacB基因的啟動子信號肽序列的質(zhì)粒。這種類型的質(zhì)粒載體是由枯草芽孢桿菌隱性質(zhì)粒與大腸桿菌質(zhì)粒構(gòu)成的穿梭載體。

pETAM：pETAM是一種適用于枯草芽孢桿菌的表達(dá)載體，它可以用來表達(dá)各種外源基因。例如，可以通過將地衣芽孢桿菌的耐高溫α-淀粉酶基因進(jìn)行耐酸性改造，并利用獲得的sacB基因的啟動子-信號肽序列（稱為sacR）構(gòu)建誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體，并實(shí)現(xiàn)了在枯草芽孢桿菌中的分泌表達(dá)。

[1]An operator-based expression toolkit for Bacillus subtilis enables fine-tuning of gene expression and biosynthetic pathway regulation