圖1 QTY code 技術(shù)流程

張曙光教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)的QTY code 技術(shù)是利用QTY電子密度的相似性，用Q、T和Y分別用來(lái)代替L、I或V和F，從而得到溶解度高的CCR5(QTY)

     圖2 PACE系統(tǒng)工作流程  

研究人員還開發(fā)出一套基于噬菌體輔助定向進(jìn)化技術(shù)來(lái)篩選。在PACE系統(tǒng)中，大腸桿菌宿主細(xì)胞培養(yǎng)液持續(xù)流入（constant inflow），含有噬菌體的宿主細(xì)胞培養(yǎng)液被持續(xù)抽走（constant outflow）。

在這過(guò)程中噬菌體會(huì)感染大腸桿菌，將自身基因組注入宿主細(xì)胞內(nèi)后進(jìn)行裝配增殖。如上圖所示，細(xì)菌中有三個(gè)組件，分別是AP、MP、SP。

其中SP是選擇性噬菌體，其含有一段目的蛋白POI和有缺陷的gIII基因。gIII基因可編碼pIII蛋白，組成噬菌體的尾部，介導(dǎo)噬菌體和大腸桿菌結(jié)合。如果噬菌體無(wú)法誘導(dǎo)pIII蛋白，則噬菌體失去侵染大腸桿菌的能力，從而不會(huì)被系統(tǒng)抽走。

AP是一個(gè)質(zhì)粒，其含有g(shù)III基因，可以彌補(bǔ)SP上缺乏的gIII基因，然而AP啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄需要POI蛋白的介導(dǎo)才能啟動(dòng)，因此，如果AP的轉(zhuǎn)錄無(wú)法啟動(dòng)，則噬菌體無(wú)法侵染大腸桿菌。而MP也是一個(gè)質(zhì)粒，其編碼了若干增加DNA突變概率的基因，并含有阿拉伯糖啟動(dòng)子。通過(guò)加入阿拉伯糖誘導(dǎo)增加DNA突變概率的基因的表達(dá)，從而引起POI蛋白出現(xiàn)不同類型的突變。而只有與AP的啟動(dòng)子結(jié)合的POI蛋白，才能侵染大腸桿菌，從而不會(huì)被該系統(tǒng)所篩選。

圖 3 PROSS和EnzymeMiner的工作流程

Barber-Zucker基于序列別對(duì)和Rosetta 建模預(yù)測(cè)中的 ΔΔGcalc 來(lái)計(jì)算位置特異性替換矩陣 (PSSM)，以找到表現(xiàn)出更高表達(dá)和穩(wěn)定性的突變的最佳組合。同時(shí)，Hon通過(guò)溶解度設(shè)計(jì)算法，優(yōu)先考慮更有可能在大腸桿菌中保留催化活性和可溶形式的序列。

圖4 常見伴侶蛋白和標(biāo)簽

目的蛋白表達(dá)過(guò)程中常會(huì)遇到包涵體的問(wèn)題，包涵體是不溶性的蛋白質(zhì)顆粒，形成原因比較復(fù)雜，可能是由于蛋白生成過(guò)快，沒(méi)有充足的時(shí)間進(jìn)行折疊，也可能是因?yàn)樵谠吮磉_(dá)系統(tǒng)中缺少翻譯后修飾，無(wú)法完成目的蛋白的正確合成。針對(duì)這種包涵體蛋白，可與輔助折疊的伴侶蛋白或者增加可溶性的標(biāo)簽蛋白進(jìn)行共表達(dá)，從而提高復(fù)雜蛋白表的可溶性。

圖5 稀有密碼子停止翻譯機(jī)理

mRNA在體內(nèi)翻譯的過(guò)程中，需要tRNA攜帶的氨基酸作為原料合成對(duì)應(yīng)的多肽。然后，如果對(duì)應(yīng)的tRNA是稀有密碼子，這會(huì)導(dǎo)致核糖體在翻譯過(guò)程中等待時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，從而被認(rèn)為是蛋白的終止翻譯，因此無(wú)法翻譯成對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)。因此，可以利用密碼子的簡(jiǎn)并性，選取肥西有密碼子替代稀有密碼子，從而優(yōu)化其蛋白的表達(dá)。

圖6 oRibo-PACE 工作流程

劉教授通過(guò)開發(fā)了一種有趣的核糖體定向進(jìn)化系統(tǒng) oRibo-PACE，以擴(kuò)大大腸桿菌、銅綠假單胞菌和霍亂弧菌的翻譯動(dòng)力學(xué)潛力。與最先進(jìn)的正交翻譯系統(tǒng)相比，oRibo-PACE 的蛋白質(zhì)產(chǎn)量提高了 6.3 倍，ncAA 的摻入效率提高了 9 倍。

圖7  Ssr A 降解錯(cuò)誤折疊蛋白機(jī)制

SsrA 是一種由 9-11 個(gè)氨基酸組成的降解決定子，可被接頭蛋白 SspB 特異性識(shí)別，在某些情況下，它與 ClpX 合作并與 SsrA 標(biāo)記的蛋白緊密結(jié)合，導(dǎo)致底物的蛋白水解（Flynn 等人，2001）。雷等人設(shè)計(jì)了一個(gè)特定的 SspB-SsrA-ClpXP 系統(tǒng)，具有更高的降解效率和 SspB-ssrA 對(duì)降解決定子 SsrA 的結(jié)合特異性，該系統(tǒng)提高了阿魏酸的產(chǎn)量，并通過(guò)工程化的 SsrA 標(biāo)記的 S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶原（SpeD）顯示出對(duì)細(xì)胞生理活性的最小干擾。

圖 8 表達(dá)宿主特征與優(yōu)勢(shì)

不同的宿主菌其基因型是不一樣的。有些經(jīng)過(guò)特殊修飾的載體，或者特殊用途的載體，或者有特殊啟動(dòng)子的載體，必須選擇合適的宿主菌進(jìn)行表達(dá)。因此，當(dāng)你的蛋白沒(méi)有表達(dá)出來(lái)時(shí)，可以考慮更換宿主菌。通過(guò)找到合適的宿主菌，可以為蛋白的表達(dá)提供合適的環(huán)境，從而成功表達(dá)蛋白。

圖9 無(wú)細(xì)胞表達(dá)流程

基于細(xì)胞的重組蛋白表達(dá)有時(shí)受到異源蛋白對(duì)宿主的毒性及其被蛋白酶降解的限制，CFE技術(shù)可以用作替代技術(shù)來(lái)克服活細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的無(wú)效性。從廣泛的宿主模式生物中制備具有轉(zhuǎn)錄能力和翻譯能力的提取物，包括從天然σ因子中激活內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄。文章總結(jié)了無(wú)細(xì)胞表達(dá)技術(shù)中制備提取物的方案及其在膜蛋白和單克隆抗體蛋白生產(chǎn)中的應(yīng)用。

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