蛋白表達(dá)|認(rèn)識(shí)質(zhì)粒

發(fā)布時(shí)間：2023-04-24

一、 蛋白表達(dá)|認(rèn)識(shí)質(zhì)粒

在做蛋白體外表達(dá)，我們首先要把需要表達(dá)的基因構(gòu)建到載體上，然后通過在導(dǎo)入到宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。那么如何看懂質(zhì)粒圖譜成為入門蛋白體外表達(dá)載體重要步驟。以Pet-28a為例子，介紹載體各元件的作用。

圖1 pET-28a載體圖譜

復(fù)制起點(diǎn)(ori)：控制著質(zhì)粒的復(fù)制，并決定了質(zhì)粒的宿主屬性和拷貝數(shù)；Ori對(duì)于復(fù)制的控制，可分為松弛型和嚴(yán)謹(jǐn)型。松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌內(nèi)的復(fù)制不受控制，拷貝數(shù)＞10個(gè)拷貝，嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒＜10個(gè)拷貝。常見的Ori如ColE1和pBR322等，屬于松弛型。若圖譜上帶有兩個(gè)復(fù)制子，是為了增強(qiáng)載體在細(xì)菌中的復(fù)制效率或提高負(fù)載能力。這種設(shè)計(jì)可以使得載體在宿主細(xì)胞中更快地復(fù)制，并在細(xì)胞系列中更穩(wěn)定地維持。

Rop: RNA隨機(jī)分解元件。rop基因編碼一種稱為RNA隨機(jī)分解蛋白（RNase）

它的主要功能是調(diào)節(jié)質(zhì)粒中RNA的穩(wěn)定性。這個(gè)蛋白負(fù)責(zé)降解過量的RNA，確保在質(zhì)粒復(fù)制過程中RNA的水平保持適當(dāng)?shù)钠胶?。通過控制RNA的降解，rop有助于維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，防止過多的RNA積累影響到質(zhì)粒的功能和復(fù)制。

Lac I: 編碼Lac 阻遏物

圖2 操縱子Lac I抑制蛋白表達(dá)原理圖

當(dāng)內(nèi)源性乳糖水平較低時(shí)，lac阻遏物（由lacI表達(dá)）能夠與lacO序列結(jié)合，并抑制T7啟動(dòng)子介導(dǎo)的目的基因轉(zhuǎn)錄。如果存在乳糖（更準(zhǔn)確地說，一種稱為異乳糖的代謝物） 或其類似物IPTG，則這些物質(zhì)會(huì)與lac阻遏物結(jié)合并改變其構(gòu)象。這可以阻止lac阻遏物與lacO結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)操縱子的去阻遏表達(dá)。轉(zhuǎn)錄后的mRNA上指導(dǎo)核糖體的結(jié)合。核糖體結(jié)合到RBS上，使得它能夠正確地起始翻譯并合成蛋白質(zhì)。

MGS：多克隆位點(diǎn)，需要表達(dá)的基因在這個(gè)位置選擇合適的酶切位點(diǎn)插入到載體中。

RBS:核糖體結(jié)合位點(diǎn)。

轉(zhuǎn)錄后的mRNA上指導(dǎo)核糖體的結(jié)合。核糖體結(jié)合到RBS上，使得它能夠正確地起始翻譯并合成蛋白質(zhì)。因此，對(duì)于構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，需要注意觀察核糖體結(jié)合位點(diǎn)的位置，防止插入后基因移碼突變，導(dǎo)致無(wú)法表達(dá)目的蛋白。

篩選標(biāo)記：多為抗性基因，以便加以檢測(cè)篩選；圖中的抗性為卡那霉素；

 表1 常用原核抗性